Die Story beginnt im Jahre 1499 und somit unmittelbar nach Assassin’s Creed 2. Die Templer sandten eine Armee, um Ezio anzugreifen. Auf der Flucht rennt er auch mit dem Pferd durch die Stadt, was schon mal die erste Neuerung ist. Denn sie können nun auch direkt in den städtischen Bereichen geritten werden. Sogar Waffen, wie beispielsweise die Armbrust, können während des Reitens verwendet werden. Es besteht sogar die Möglichkeit von einem Pferd auf eines vom Gegner zu springen, den Gegner hinunterzustoßen und dann darauf weiterzureiten. Selbst für die Akrobatik ist das Pferd gut zu gebrauchen, wenn während des Reitens kann er auch abspringen und von dort aus zu Fuß weiter flüchten.
Nachfolgend beginnt ein harter Kampf, bei denen zunächst sogar mit Kanonen auf gegnerische Türme geschossen wird, welche daraufhin sehr gut dargestellt einstürzen. Kurz darauf stürmen die Angreifer jedoch das Gebiet und Ezio muss seine Nahkampffähigkeiten unter Beweis stellen. Die Kämpfe versprechen schneller und vielseitiger zu werden und die KI wird viel aggressiver agieren. So werden mehrere Gegner gleichzeitig angreifen können und dabei Gebrauch verschiedener Waffen machen. Der Spieler hingegen wird dafür in einer schnellen Abfolge mehrere Gegner unter Einsatz verschiedener Waffen bekämpfen können. Einige Einheiten sind etwas stärker und müssen zunächst mit einem Tritt geschwächt werden, ehe sie dann schnell neutralisiert werden können.
In der nächsten Szene erscheint Cesare Borgia, der Erzfeind in diesem Spiel, und es fällt ein Schuss. Was genau passiert, lässt sich wohl eher nur vermuten. Ezio geht daraufhin zu Boden und der Abschnitt ist zu Ende. Bis hierhin größtenteils Informationen, wie sie dem Singleplayer-Walkthrough-Video zu entnehmen sind. Nach einem kurzen Schnitt wird die Geschichte vom Jahre 1503 fortgeführt. Sie findet in der italienischen Hautpstadt Rom statt, welche in Assassin’s Creed Brotherhood mehr als drei Mal so groß wie Mailand in Assassin’s Creed 2 sein wird und in mehrere große Gebiete aufgeteilt ist. Dort gilt es die Türme der Borgia-Familie zu zerstören, indem der jeweilige Anführer eines Turms getötet. Anschließend kann er, wie bei den vorherigen Aussichtstürmen, erklommen werden, um zunächst einmal einen Überblick über die Umgebung zu erhalten. Danach wird, während Ezio in die Tiefe springt, der Turm in die Luft gesprengt. Damit hat die Borgia-Familie über diesen Bereich keine Kontrolle mehr und es können Läden errichtet werden.
Doch die wichtigste Neuerung ist die Bruderschaft, welche Ezio zur Seite steht. Hierfür werden nach und nach weitere Assassinen rekrutiert und ausbildet. Die Mitstreiter können auf Missionen geschickt werden, um Erfahrungspunkte zu sammeln und schließlich auch in ihrem Level aufsteigen. Dabei gibt es unterschiedlich schwere Aufgaben, für welche es in Abhängigkeit des aktuellen Levels eine bestimmte Erfolgswahrscheinlichkeit gibt. Diese ist ziemlich wichtig, denn ist sie zu niedrig, wird der Assassine scheitert. Für ihn würde das den Tod bedeuten und Ezio hätte damit einen Anhänger weniger. Durch ihre Erfahrung verdienen die Assassinen auch Fähigkeitspunkte, welche für Rüstung, Waffen oder zusätzliche Ausrüstung vergeben werden können. Dies ist nicht nur für weitere Missionen hilfreich, sondern auch für die Unterstützung von Ezio.
Der Spieler hat die Möglichkeit bestimmte Gegner anzuvisieren und dann die Unterstützung der Bruderschaft in Anspruch zu nehmen. Die Mitstreiter schalten dann die Gegner mit Pfeil und Bogen oder auch im Nahkampf aus, während sich Ezio auf sein eigentliches Ziel konzentrieren kann. Das ganze Erfolgt mit einem Tastendruck und nennt sich Brotherhood Assistant Move (kurz BAM). Der Vorgang ist jedoch nur beschränkt möglich, da er auch immer wieder neu aufgeladen werden muss.
Mithilfe eines Fallschirms kann bei einem Sprung auch sanft über die Stadt geglitten werden, um dann in einem Heuhaufen oder auch direkt auf deinem Pferd landen zu können. Eine weitere Neuerung des Spiels ist der Multiplayermodus, auf welchen nicht weiter eingegangen wurde. Jedoch gibt es auch hierzu ein Walktrough-Video auf unserer Seite, welche einen Überblick über die Modi bietet.